犬骨髓干细胞对犬白细胞减少症的治疗效果研究

汪登如  施云平  曹景锋  谢丽君  闫晓霞  严玉霖

(1．昆明爱美森宠物医院 昆明 650224；2．公安部昆明警犬基地 昆明 650201；

3．云南农业大学动物科学技术学院 昆明 650201)

摘要: 为探讨犬骨髓干细胞对犬白细胞减少症的治疗效果，从健康幼犬骨髓中体外分离培养并鉴定骨髓干细胞，主要包括骨髓造血干细胞和间充质干细胞，通过静脉移植对犬白细胞减少症进行治疗并观察效果。结果显示，利用犬骨髓干细胞治疗犬细小病毒感染导致白细胞减少或缺乏症的治愈率为90%，治疗由药物原因引起的白细胞减少症的治愈率为100%，疗程短，疗效好，能够快速提高患犬的生活质量。研究结果表明犬干细胞在犬白细胞减少症等犬类疾病的治疗中具有独特的治疗效果和巨大的应用价值。

关键词：犬骨髓干细胞  犬白细胞减少症  治疗效果

Study on the therapeutic effect of canine bone marrow derived stem cells against canine leucopenia

Dengru Wang, Jingfeng Cao, Lijun Xie, Xiaoxia Yan, Yulin Yan

(1. Kunming Amth pet hospital, Kunming, 65000; 2. Kunming police dog base of Minister of Public Security, Kunming, 650201; 3. College of animal science and technology, Yunnan agricultural university, Kunming, 650201.)

Abstract: In order to explore the therapeutic effect of canine bone marrow derived stem cells against canine leucopenia, the bone marrow derived stem cells including hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells were isolated, cultured and identified. These cells were transplanted through vein to treat the canine leucopenia. The results showed that the cure rate for leucopenia by canine parvovirus was 90%, the cure rate for leucopenia by drug was 100%, which could improve the dog’s life quality quickly. The results indicated that the canine bone marrow derived stem cells have the unique therapeutic effect and significant practical application value against canine disease.

Key words: canine bone marrow derived stem cells, canine leucopenia, therapeutic effect.

    随着分子生物学技术和细胞工程技术的飞速发展，近年来干细胞尤其是成体干细胞的研究与应用已经成为当今生命科学和医学研究领域一个新的途径和热点。已有研究表明，从干细胞的角度有可能找到人类和动物生命发生发展的本质和规律，寻找到延年益寿、延缓衰老、组织器官功能重建和各种疾病治疗的有效措施[1]。

    骨髓作为机体最大的干细胞库，含有大量可以分化为各种细胞类型的干细胞，主要包括造血干细胞和间充质干细胞，胚胎干细胞样多潜能成体祖细胞，还可能存在有其他类型的干细胞[2]。其中造血干细胞和间充质干细胞，在体内外具有很强的增殖能力和多向分化潜能。造血干细胞可以用于造血和免疫功能重建，已在临床上用于血液肿瘤根治、实体瘤辅助治疗以及遗传性疾病、免疫异常症、难治性感染等多种类型的疾病治疗；间充质干细胞在适宜刺激下能在体内外分化为脂肪、软骨、骨、肌腱、肝、肾、神经、皮肤、肌肉等十余种成熟细胞和组织[3]。目前骨髓干细胞在体内外的多向分化潜能的发现及在临床疾病治疗中的应用显示出重大的科学和实用价值。

    犬白细胞减少症是犬临床中常见的危害较大的疾病。白细胞可分为粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，其中粒细胞分为嗜酸、嗜碱性细胞、嗜中性，淋巴细胞分为T淋巴细胞和B淋巴细胞。白细胞的主要功能是承担动物机体的免疫任务，白细胞减少(白细胞总数<6×103l)就可使机体免疫功能下降。引起犬白细胞减少症的主要原因是病毒性感染(如犬细小病毒和犬瘟热病毒)和药物原因(如抗生素、抗病毒药和解热镇痛药等) [4]。犬发生白细胞减少症时，临床表现可见精神不振，全身无力，患病毒性肠炎时可见病犬流涎，体温升高，食欲废绝，恶心呕吐，部分病例可见肺部或泌尿系统感染；发展为急性粒细胞缺乏时，死亡率可高达80%，常因迅速发生败血症或脓毒血症而突然死亡[5]。

    虽然骨髓干细胞在人类医学的研究和应有中发挥着巨大的作用，但在犬类疾病的治疗中尚无相关报道，本文就犬骨髓干细胞对犬白细胞减少症的临床治疗效果进行探讨，为犬骨髓干细胞的临床应用提供理论依据和技术支撑。

    1材料与方法

    1.1实验材料

    特级胎牛血清FBS、DMEM F12培养基、dPBS、胰蛋白酶、EDTA；鼠源一抗CD34、CD44、CD11a、HLA2DR(美国VMRD公司)；FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

    1.2犬骨髓干细胞的制备

    根据专利“同时分离培养犬骨髓间充质干细胞和多功能造血干细胞的方法(专利号：201410405353. X)”描述的方法从健康幼犬的骨髓中分离出骨髓干细胞，体外进行培养，倒置显微镜下观察干细胞的生长、增殖情况；随后按1: 3连续传代，在液氮中保存备用。

    1.3犬骨髓干细胞的鉴定

    形态学鉴定：倒置显微镜下观察骨髓干细胞的增殖状态；流式细胞仪检测骨髓干细胞的生长周期及干细胞的表面抗原特性：CD44、CD14、CD34、CD11a、HLA2DR。

    1.4临床病例的选择

    选择2014年10月至2015年6月来昆明爱美森宠物医院就诊的患犬，由犬细小病毒感染继发白细胞减少或缺乏病例10例，其中3例发展至白细胞无法检出；由药物原因引起的白细胞减少症5例。

    1.5干细胞治疗方法

    治疗剂量：中小型犬用量每次106-107个，大型犬每次用量为108-109个。治疗方法：对于犬细小病毒感染的病例按常规的抗病毒和补液进行治疗后，将犬骨髓干细胞用注射用生理盐水稀释，通过静脉移植(注射)于患犬体内，每天一次，连续三次；由药物原因引起的白细胞减少症时立即停止使用药物，注射用理盐水稀释，静脉注射，每天一次，连续两次。

    1.6临床治疗效果观察

    观察治疗后的精神状态、体温、食欲，临床症状和血象指标。

    2结果

    2.1犬骨髓干细胞的形态学观察结果

    从骨髓中分离出的单个核细胞接种培养(原代培养) 24h，即可见少量的骨髓间充质干细胞贴壁和大量悬浮的圆形细胞，48h后细胞贴壁呈长梭形纤维细胞状，细胞两极端有细丝。48h后细胞首次半量换液，去除绝大部分未贴壁细胞，贴壁细胞迅速增殖分裂，72h后可见瓶底明显集落形成的贴壁骨髓间充质干细胞和悬浮的骨髓造血干细胞(图1 A)。第7天换液并传代，见原来的单个细胞或细胞集落形成多细胞克隆，直至彼此相连、互相融合铺满培养细胞瓶底(图1 B)。

刚传代的细胞呈圆形，很快贴壁、伸展为三角形、多角形，并逐渐变成短梭形、长梭形，部分圆形细胞悬浮，折光性差，3～5天增殖迅速，6～7天铺满培养瓶底。连续培育8代以上，细胞形态、增殖特性未发生改变。

图1 犬骨髓干细胞形态学观察(×200)

A. 犬骨髓干细胞培养72h时的形态：贴壁的细胞呈长梭形，悬浮的细胞呈圆形。

B. 犬骨髓干细胞培养7天时的形态：细胞集落形成多细胞克隆。

    2.2犬骨髓干细胞的流式细胞仪鉴定结果

    流式细胞仪检测BMMSCs周期结果显示：G1、S、M、G2期细胞所占比例分别为7.0%、25.6%、15%、52.4%(图2 A)，表明多数细胞处于活跃的增殖期，显示出慢周期性和自我更新能力。

    流式细胞仪检测骨髓干细胞的表面抗原特性结果：强表达CD44阳性细胞率98.6%、HLA2DR阳性率为1.37%、CD34阴性、CD11a阴性，符合骨髓干细胞的分子生物学特性(图2 B)。

图2  流式细胞术鉴定结果图

A. 骨髓干细胞周期检测结果：红色代表G1期，蓝色代表S期，棕色代表M期，绿色代表G2期。 

B. 骨髓干细胞表面标记物检测结果，Q1：HLA2DR阳性率为1.37%，Q2：CD34阴性，Q3：CD11a阴性，Q4：CD44阳性率为98.6%。

    2.3犬骨髓干细胞对犬白细胞减少症的治疗效果及病例

    犬细小病毒感染病例：就诊时患犬精神沉郁，鼻镜干燥，口腔黏膜苍白，心律不齐，肠音消失，腹部触诊疼痛性呻吟，反复呕吐，排血便，个别患犬体温升高至39.6～40.5℃，用胶体金试纸条检测细小病毒抗原阳性。病例按常规的抗病毒和补液进行治疗的同时，静脉注射犬骨髓干细胞，治疗当天患犬精神有所好转，第二天白细胞数量上升，第三天恢复至正常，结合犬细小的常规治疗，迅速治愈，疗程短，效果好。

    我们用犬骨髓干细胞治疗犬细小病毒感染继发白细胞减少或缺乏病例10例， 其中3例发展至白细胞无法检出，1例死亡（注：患病5天后出诊入院），故应用犬骨髓干细胞治疗由犬细小病毒引起的白细胞减少或缺乏症的治愈率为90%，两例典型病例如表1、表2所示；全部治愈由药物原因引起的白细胞减少症5例，治愈率为100%。

表1 典型病例：比熊犬，3月龄，犬细小病毒感染，第3天康复

表2 典型病例：雪纳瑞，8月龄，犬瘟热和细小病毒混合感染，第5天康复

    3讨论

    干细胞治疗技术作为一种新型的疾病治疗手段，克服了临床常规治疗的局限性，为人类和动物疾病的治疗打开了全新的思路，以成体干细胞移植为代表的细胞疗法在生长发育、免疫治疗、组织修复、基因治疗、造血支持疗法等领域中得到越来越广泛的应用，在医学领域发挥着重要的作用。成体干细胞在生理状态下完成组织的更新，在病理状态下实现对组织的修复，后一过程包括动员、归巢、分化三个环节。其可能的作用机制如下[6]：(1)分化作用：干细胞作为新兴的种子细胞是一种具有多向分化潜能的细胞。受损器官或成年个体组织损伤的机体，能发出特异的信号，将干细胞招募到受损部位并发挥修复功能。它给人的提示是干细胞定位到靶组织后，在体内微环境的作用下，能定向分化成所需的组织细胞类型或者可通过模拟体内环境，在体外实现干细胞的定向诱导分化，因此移植干细胞能自我更新并可分化成多种细胞，对组织器官进行修复。(2)旁分泌作用：干细胞能够分泌大量细胞因子，以间充质干细胞为例，其分泌因子在功能上主要可分为免疫调节、抗细胞凋亡、血管发生、支持干/祖细胞的增殖与分化、化学趋化、抗瘢痕六大类。它们通过自分泌或旁分泌的方式，改善机体局部微环境，促进内源性干细胞向伤口部位的迁移和分化，挽救濒临凋亡的细胞，从而达到修复组织和治疗疾病的目的。

    骨髓中存在有多种类型干细胞，主要为骨髓造血干细胞和间充质干细胞，其中：造血干细胞是产生血液有形成分的祖细胞，它们在造血组织中维持着恒定的数量，并不断地分化出红系、粒系和巨核细胞系等各种血细胞的功能。骨髓间充质干细胞来源于骨髓基质，是基质细胞系的祖细胞，通过自我更新和多向分化特性，在造血微环境、造血调控中发挥重要作用。其功能有：对骨髓血系细胞起支持诱导作用，即造血支持功能；免疫调节/增强作用；具有多种生物活性物质的分泌能力。在特定的诱导条件下可分化为成脂肪、软骨、骨、肌腱、肝、肾、神经、皮肤、肌肉等十余种成熟细胞[7]。

    犬细小病毒(Canine Parvovirus, CPV)是1977年美国Eugster从患出血性肠炎病犬粪便中新发现的一种小DNA病毒，可使犬发生严重的出血性肠炎综合征或/和心肌炎，发病率为50~100%，死亡率10~50%，是对养犬业危害极大的疫病之一[8]。目前临床中主要以抗病毒治疗辅助补液治疗为主，如不及时就诊，表现为白细胞减少，贫血，呼吸困难，脱水，最终导致急性衰竭而死亡。我们对患犬进行常规治疗的同时，利用体外分离培养的骨髓干细胞进行静脉输注，取得了令人满意的治愈率。从血象指标的快速恢复和临床症状的减轻进行评估，本文中应用犬骨髓干细胞治疗犬细小病毒感染导致白细胞减少或缺乏症的治愈率为83.89%，治疗由药物原因引起的白细胞减少症的治愈率为100%，治愈时间短，能够快速提高患犬的生活质量。表明骨髓干细胞有很强的可塑性，可通过静脉注射进入血液循环，随血液循环分布全身各组织。在体内的血液中造血微环境的调控网络作用下，骨髓干细胞分化成白细胞，红细胞，淋巴细胞和单核细胞，恢复血象，增强机体的免疫功能。另外损伤的组织可释放一些干细胞趋化因子，随血液循环到组织中的骨髓干细胞被招募到受损组织，在特定微环境中诱导分化为功能细胞和参与肠道黏膜组织、心肌组织和肝脏组织等损伤组织的修复，从而达到治愈的目的。

    在欧美等发达国家的宠物医院，犬干细胞在老年犬的保健和疾病治疗等方面已经得到较为广泛地应用。我们利用犬骨髓干细胞成功治愈犬白细胞减少症在国内尚属首次，为国内开展犬干细胞在犬类疾病治疗的研究与应用奠定了坚实的理论基础，提供了可靠的技术支撑，这具有重要的科学意义和巨大临床应用价值。可以预想，在不远的将来，犬干细胞的基础研究和临床应用将对犬病保健和治疗领域带来巨大的变革，犬类的健康将会得到极大的促进和提高。

    参考文献

    [1] van Koppen CJ, Hartmann RW. Advances in the treatment of chronic wounds: a patent review. Expert Opin Ther Pat. 2015 3(1):1-7.

    [2] Ratajczak MZ, Jadczyk T, Pędziwiatr D, et al. New advances in stem cell research: practical implications for regenerative medicine. Pol Arch Med Wewn. 2014, 124(7-8): 417-426. 

    [3] Mezey É, Nemeth K. Mesenchymal Stem Cells and infectious diseases:Smarter than drugs. Immunol Lett. 2015, 4: S0165-2478(15)00096-6.

    [4] Schnelle AN1, Barger AM. Neutropenia in dogs and cats: causes and consequences. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2012, 42(1): 111-122.

    [5] Shimokawa Miyama T1, Umeki S, Baba K, et al. Neutropenia associated with osteomyelitis due to Hepatozoon canis infection in a dog. J Vet Med Sci, 2011, 73(10): 1389-1393.

    [6] Kim SJ, Cho HR, Cho KW, et al. Multifunctional cell-culture platform for aligned cell sheet monitoring, transfer printing, and therapy. ACS Nano, 2015,9(3): 2677-2688.

    [7] Pelagiadis I1, Stiakaki E1, Choulaki C, et al. The role of children's bone marrow mesenchymal stromal cells in the ex vivo expansion of autologous and allogeneic hematopoietic stem cells. Cell Biol Int, 2015, 24(4). doi: 10.1002/cbin.10483.

    [8] Kaur G, Chandra M, Dwivedi PN, et al. Antigenic typing of canine parvovirus using differential PCR. Virus disease, 2014, 25(4): 481-487.

    致谢

        感谢美国堪萨斯州立大学兽医学院提供的技术支持与热心帮助。